1. Date
Day 1 – 2008년 10월 27일 월요일
2. Subject & Purpose
Digestion of DNA with Restriction Enzyme & Agarose Gel Electrophoresis & Gel Purification
Plasmid pET vector와 FabG gene이 insert된 pET vector를 두 가지 제한효소, BamHⅠ과 NdeⅠ으로 자른 다음 전기영동을 통해 결과를 확인하고 Purification을 한다.
3. Principle
1) Restriction enzy
제한효소가 인식하는 부위는
5'--CCCGGG--3' 5'--CCC GGG--3'
3'--GGGCCC--5' 를 인식해서 3'--GGG CCC--5' 와 같이 수직으로 자르며 이를 blunt end 형태라고 부른다
3. 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의한 유전자의 분리
a. Agarose gel 전기영동 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들로는 DNA의 분자
DNA electrophoresis(agarose gel)
(1) 기본원리
DNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 기본원리를 갖는다. 이때 DNA분자가 gel matrix사이를
제한효소를 이용한 DNA 절단 및 분석, Ligation
3.1.1. Digestion of DNA with Restriction Enzyme
I. Apparatus
- Water bath, brief centrifuge
II. Reagents
- Plasmid, DDW, restriction enzymes [NdeI, BamHI], restriction enzyme reaction buffer
① NdeI: an endonuclease isolated from Neisseria denitrificans. In molecular biology, it is commonly used as a restriction enzyme.
② BamH
전기영동 tank에 1 X TAE를 넣은 후 gel을 넣는다. (이 때 TAE buffer는 gel이 살짝 잠길 정도로 붓는다.)
④ 2 µl의 100bp DNA ladder를 loading하여 DNA size marker로 사용한다.
⑤ 확인하고자 하는 plasmidDNA를 차례로 DNA loading buffer(1 µl)와 섞은 후, 각각의 well에 loading한다.
⑥ 75V 전압에서 전기영동을 하여, DNA가
DNA가 있다.
3. 두 DNA 조각을 공유결합으로 연결: DNA ligase가 이 역할을 담당한다. 두 가지 이상의 재료에서 유래된 DNA조각들이 공유결합으로 연결되어 구성된 DNA 분자를 recombinant DNA(재조합DNA)라고 한다.
4. 재조합 DNA를 시험관으로 이동: DNA 복제를 위한 효소 장치를 제공하는 숙주세포로 이동시킨다.
5.
1. DNA를 자른다는 것은 nucleotide를 연결하고 있는 phosphodiester bond를 끊어여러 DNA 단편을 만들어 내는 것을 의미한다. 이 때, 이런 역할을 하는 효소를nuclease라고 하며 그 종류로는 바깥 쪽을 절단하는 효소인 exonuclease와 안쪽을 절단하는 endonuclease가 있다.
2. 대표적 endonuclease인 제한효소(restriction enzyme)는
DNA with Restriction Enzyme]
실험준비물 :
Materials-restriction enzymes (ndeⅠ,BamhⅠ), restriction enzyme reaction buffer, DDW
Equipments-water bath, brief centrifuge
Procedure :
① e-tube를 두 개 준비하여, 각각 plasmid only와 inserted plasmid를 5μl 넣고, DDW 2μl,10x reaction buffer, 제한효소를 각각 1μl 넣는다. 제한효소를 가장 마지막에 넣는
buffer는 MgCl2를 포함하며 제한효소에게 금속이온으로써 보조인자 역할을 한다.
- 효소 및 DNA의 냉동보관 이유 : 효소는 -20℃, 50% glycerol이 들어있는 완충액 내에서 안정하게 존재한다. DNA를 상온에서 보관할 경우 DNA간 충돌에 의해 파괴될 수 있기 때문에 냉동보관 해야 한다.
- centrifuge의 원리 : centrifuge
Plasmid의 면들은 서로 그 면의 모양이 달라서 잘 붙지 않는다. 두 가지의 제한효소를 사용하기 위해선 두 제한효소로 잘리는 부위가 너무 가깝지는 않은지 검토해보아야 하고, 두 제한효소의 반응 조건도 검토해보아야 한다. 고유조건이 같으면 고유 Buffer를 쓰고 다르면 One-phor-all buffer의 조건을 맞추고,